小鼠原代真皮成纖維細胞的分離與培養

1. 組織消化與細胞分離
將剪碎的真皮組織轉移至15 mL離心管中，加入預熱的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（含1%膠原酶Ⅰ），37℃水浴消化30分鐘，期間每10分鐘輕柔吹打一次以促進組織解離。消化完成后，加入等體積含10% FBS的DMEM培養基終止反應，1000 rpm離心5分鐘，棄上清。

2. 細胞懸液制備與接種
用PBS重懸細胞沉淀，經70 μm細胞篩過濾去除未消化的組織塊，再次離心后以完全培養基（DMEM+10% FBS+1%雙抗）重懸。調整細胞密度至5×10? cells/mL，接種于預先包被0.1%明膠的培養皿中，置于37℃、5% CO?培養箱中靜置培養。

3. 原代細胞培養與觀察
24小時后更換新鮮培養基以去除未貼壁細胞，此后每2-3天換液一次。在倒置顯微鏡下觀察，成纖維細胞通常呈梭形或多角形，貼壁生長后可形成典型的放射狀或漩渦狀排列。若發現雜細胞（如角質形成細胞）污染，可采用差速貼壁法純化：將細胞懸液接種30分鐘后，轉移未貼壁細胞至新培養皿繼續培養。

4. 細胞傳代與凍存
當細胞融合度達80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶消化2-3分鐘，按1:2至1:3比例傳代。凍存時以含10% DMSO的完全培養基調整細胞密度至1×10? cells/mL，分裝至凍存管后程序降溫，長期保存于液氮中。

注意事項
- 組織消化時間需根據小鼠年齡調整（幼鼠組織更易消化）；
- 原代細胞前3代增殖活躍，建議優先使用P3-P5代細胞進行實驗；
- 定期檢測支原體污染，培養液中可添加2.5 μg/mL兩性霉素B預防真菌污染。